摘要：每天2次注射FSH，進(jìn)行牛的超排必須處理得當(dāng)，否則由于基層技術(shù)人員的誤操作將提高超排失敗的可能性。我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)試驗(yàn)，應(yīng)用透明質(zhì)酸為基礎(chǔ)的緩釋物（SRF）稀釋促卵泡素V，然后單次肌肉內(nèi)（IM）注射肉牛，進(jìn)行超排效果的評(píng)估。試驗(yàn)1，將奶牛分成3組，進(jìn)行每天2次的注射程序與2種注射方法的對(duì)比研究；為期4天，每天2次（對(duì)照組）的IM的牛（n=6）的超排反應(yīng)，大于單次皮下（注射SC）SRF（n=6），而奶牛（n=6）單次IM的SRF的反應(yīng)位于兩者之間。試驗(yàn)2，比較單次IM注射程序中，兩種SRF的濃度（20mg/ml的透明質(zhì)酸，100% 對(duì)比10mg/ml的透明質(zhì)酸，50%）影響。結(jié)果黃體（CL）的平均數(shù)沒有顯著差異（P≥0.05），但總的卵子/胚胎數(shù)（P＜0.05）、受精卵（P＜0.01）和可移植胚胎數(shù)（P＜0.001），100% SRF處理組（n=20）是優(yōu)于50% SRF處理組（n=20）。試驗(yàn)3，在紅色安格斯奶牛上對(duì)比單次IM 100% SRF 稀釋的FSH效果，與傳統(tǒng)的為期4天，每天2次的超排效果。CL的平均數(shù)（13.7±1.2 VS 13.8±1.2），總胚胎數(shù)（12.3±1.5 VS 13.7±1.2），受精卵（7.2±1.1 VS 8.4±1.4）和可移植胚胎（4.9±0.8 VS 6.4±1.3），在對(duì)照組（n=29）和單次注射組（n=29）中沒有顯著差異。

1. 前言

肉牛超排處理的主要目的是誘發(fā)更多的排卵，致使產(chǎn)生更多的可移植胚胎和移植后的更高妊娠率。然而，供體對(duì)于促性腺激素的處理有很大的變異性，其對(duì)胚胎移植也有主要的影響。最近對(duì)發(fā)情周期和卵泡波的研究進(jìn)展表明，在卵泡波啟動(dòng)的時(shí)候用激素處理將獲得較好的超排效果，卵泡波的同期啟動(dòng)方法現(xiàn)在已有較優(yōu)的設(shè)計(jì)。

供體牛的超排處理可以通過傳統(tǒng)的單次IM 孕馬血清促性腺激素（eCG），或者每日2次IM垂體提取物FSH來實(shí)現(xiàn)，孕馬血清促性腺激素是一種復(fù)雜的糖蛋白激素，其半衰期為40小時(shí)，單次注射可引起超排；而FSH在奶牛體內(nèi)的生物半衰期不足5小時(shí)，必須多次處理才能誘發(fā)超排。用垂體提取物每日2次的IM處理的超排反應(yīng)優(yōu)于每日1次的處理。因此，垂體衍生物激素的處理必須謹(jǐn)慎，否則由于錯(cuò)誤處理貨注射將提高失敗的可能性，另外，每日兩次的處理將引起供體牛的過度應(yīng)激，這將使得以后的超排反應(yīng)逐漸減弱。故簡(jiǎn)單的卵泡超排程序?qū)⒂型麥p少供體牛的超排處理費(fèi)用，提高其反應(yīng)能力，尤其對(duì)不易處理的動(dòng)物而言。

用垂體粗提物（FSH-P），以明膠鹽為媒介稀釋后一次性快速注射后的效果類似于每日兩次，共5天的超排程序，然而，這單次注射的產(chǎn)生的可移植胚胎數(shù)非常少。其他人也用FSH氫氧化鋁凝膠或聚維酮制劑的，但其結(jié)果不穩(wěn)定。然而，也有一個(gè)擔(dān)憂就是垂體提取物和這些集合物的超排，可能使得牛體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)FSH 的抗體物。

    單次注射FSH程序?qū)⑹莻鹘y(tǒng)的每日2次處理程序的牛超排處理的選擇途徑之一，單次處理程序可能更加適用于缺少技術(shù)人員的牛場(chǎng)。在一項(xiàng)使用垂體純提取物，促卵泡素V超排研究中，單次皮下注射400mg NIH-FSH-P1肉用奶牛的媒介物，體況較高（＞3/5）的牛的超排反應(yīng)與傳統(tǒng)的每日2次、共4天的處理結(jié)果相似，然而，此結(jié)果在有較少皮下脂肪組織的荷斯坦奶牛上未能重復(fù)。在另一項(xiàng)荷斯坦奶牛的研究中，單次注射的FSH-V被分成2份，在處理的第一天皮下注射75%，48小時(shí)后注射剩余的25%，而前列腺素是正常注射，超排反應(yīng)與傳統(tǒng)的4天處理程序沒有不同，促卵泡素V的單次皮下注射與牛的體況和性情有關(guān)，更易接受超排處理的牛將會(huì)得到更優(yōu)的效果。

    一個(gè)可選用的穩(wěn)定的單次FSH注射的超排反應(yīng)應(yīng)該是將促卵泡素V和可生物降結(jié)合解的高分子聚合物相結(jié)合，來維持在幾天內(nèi)穩(wěn)定慢速的釋放激素。有好幾種生物或合成的不同材料性質(zhì)的聚合物可用于維持藥物的緩慢釋放，這些物質(zhì)是可降解的，對(duì)生物體組織沒有免疫反應(yīng)，適合于在動(dòng)物體內(nèi)使用，其中一種就是以透明質(zhì)酸為基礎(chǔ)的物質(zhì)（SRF），在以前的研究中，就將促卵泡素V用SRF稀釋后單次注射進(jìn)動(dòng)物體，可誘發(fā)超排反應(yīng)。一系列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-評(píng)估使用SRF稀釋的促卵泡素V單次IM后，肉奶牛的超排反應(yīng)，主要目的是確定使用SRF稀釋后的促卵泡素V單次注射的位點(diǎn)，對(duì)超排反應(yīng)的穩(wěn)定性（試驗(yàn)1）；比較兩種不同濃度的SRF的IM注射結(jié)果（實(shí)驗(yàn)2）；在安格斯奶牛上，比較注射SRF稀釋后促卵泡素V和注射每日兩次的生理鹽水，證實(shí)前者誘發(fā)超排反應(yīng)的能力。

2. 材料與方法

實(shí)驗(yàn)1是用SRF稀釋后的促卵泡激素V注射不同位點(diǎn)的比較，雜種肉用奶牛（n=18）被隨機(jī)的分成3組，在第0天（開始處理天），所有的奶牛注射5mg  17β-雌二醇和50mg孕激素，并植入含1.56g 孕激素的陰道栓，在第4天，按以下處理進(jìn)行奶牛的超排處理：第一組（對(duì)照組）：用生理鹽水稀釋400mg的 NIH-FSH-P1，每天2次頸部IM注射逐漸遞減注射4天（80，80,60,60,40,40,20,20）；第二組：用10ml的SRF（20mg/ml 透明質(zhì)酸）稀釋400mg的 NIH-FSH-P1頸部IM注射； 第三組：在用10ml的SRF稀釋400mg的 NIH-FSH-P1耳部皮下（SC）注射。對(duì)于單次注射，是先將促卵泡素V用1ml的生理鹽水稀釋，然后注射進(jìn)含有9ml、濃度為22mg/ml 的透明質(zhì)酸的小瓶中，輕微搖勻，并吸進(jìn)12ml的注射器中進(jìn)行注射。在第6天的早上和下午（FSH開始處理后的48小時(shí)），所有牛注射150mg PGF，并在下午撤栓。在第8天的早上注射12.5mg的LH，并在12和24小時(shí)后進(jìn)行輸精。如果奶牛在第7天下午穩(wěn)定接受爬跨，12小時(shí)后進(jìn)行LH的注射和輸精，在第15天非手術(shù)法收集胚胎，并按照IETS的方法評(píng)估質(zhì)量，IETS評(píng)估質(zhì)量為1和2級(jí)的胚胎則認(rèn)為是可移植的胚胎。

實(shí)驗(yàn)2是比較2種不同SRF濃度通過單次IM注射促卵泡素V后超排反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)分2階段進(jìn)行處理，第一階段，15頭紅色安格斯奶牛按交叉設(shè)計(jì)進(jìn)行兩次超排處理，第二階段，10頭紅色安格斯奶牛隨機(jī)分成兩組，進(jìn)行一次超排處理，在第4天時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)1的單次處理程序用400mg的NIH-FSH-P1進(jìn)行頸部IM注射，單次注射的試劑是將促卵泡素N的凍干粉末用1ml的生理鹽水稀釋，然后在12ml的注射器中與9ml的SRF（22mg/ml 透明質(zhì)酸，100%溶液）或者50%的SRF稀釋（11mg/ml 透明質(zhì)酸，50%溶液）在處理前混勻。輸精、胚胎采集和評(píng)估均按照實(shí)驗(yàn)1的進(jìn)行處理。

實(shí)驗(yàn)3是證實(shí)前面的結(jié)果，并比較用100%的SRF稀釋的促卵泡素V的單次IM注射和傳統(tǒng)的生理鹽水稀釋的促卵泡素V的每日2次的IM注射對(duì)紅色安格斯供體奶牛的超排影響，實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)階段：第1階段，17頭紅色安格斯奶牛按交叉設(shè)計(jì)進(jìn)行兩次超排處理，第二階段，24頭紅色安格斯奶牛隨機(jī)分成兩組，進(jìn)行一次超排處理，在第4天時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)1的用400mg的NIH-FSH-P1按每日兩次為期4天的遞減或按單次進(jìn)行頸部IM注射，單次注射的試劑是將促卵泡素N的凍干粉末用1ml的生理鹽水稀釋，然后在12ml的注射器中與9ml的SRF（22mg/ml 透明質(zhì)酸，100%溶液）在處理前混勻，同實(shí)驗(yàn)2。輸精、胚胎采集和評(píng)估均按照實(shí)驗(yàn)1的進(jìn)行處理。

2.1 超聲波

所有的奶牛在第0天和第4天檢查黃體的存在，卵泡的大小和數(shù)量，奶牛的卵巢在超排處理期間（4-8天），每天都進(jìn)行卵泡生長(zhǎng)特性的超聲波檢測(cè)，在11天檢測(cè)排卵數(shù)量，在15天通過直腸檢查黃體數(shù)量來證實(shí)超排反應(yīng)。

2.2 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)1中的數(shù)據(jù)（連續(xù)的狀態(tài)分布和變異）按ANOVA進(jìn)行評(píng)估，平均數(shù)通過LSD測(cè)試進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)2和3的數(shù)據(jù)通過平方根被初步轉(zhuǎn)化，然后使用Infostat進(jìn)行ANOVA分析，通過保護(hù)LSD測(cè)試進(jìn)行平均數(shù)的比較，ANOVA混合模式檢測(cè)天數(shù)、處理和天數(shù)與處理互作對(duì)≥9mm卵泡直徑和數(shù)量的影響，處理組間平均卵泡直徑的統(tǒng)計(jì)比較、每頭牛的平均卵泡直徑在卵巢上出現(xiàn)大于3mm的卵泡時(shí)開始進(jìn)行測(cè)試。

3. 結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果如表1所示，總胚胎數(shù)、受精卵和可移植胚胎數(shù)，用400mg FSH按每日2次為期4天的IM注射比按400mg  FSH單次耳部SC注射效果顯著好（P＜0.05）。而用單次IM注射后獲得的總胚胎數(shù)、受精卵和可移植胚胎數(shù)處于中間水平，與其它處理組間沒顯著差異。圖1表示了在超排處理期間直徑≥9mm的平均卵泡數(shù)。在所有的處理組中，直徑≥9mm的平均卵泡數(shù)在第5-8天時(shí)增加（即在第一次FSH處理后的24小時(shí)），此后則減少（天的影響，P＜0.001），此外，在6-8天，用每日2次IM注射促卵泡素V的方法，將有更多的≥9mm的卵泡生成。

    在試驗(yàn)2，在第1和2階段之間，沒有差異，所以將數(shù)據(jù)結(jié)合在一起。盡管CL的平均數(shù)沒有顯著的差異，但總的卵子/胚胎數(shù)（P＜0.05）、受精卵（P＜0.01）和可移植胚胎數(shù)（P＜0.001）用100% SRF溶液的比50% 的要好的多（表2）。在胚胎采集時(shí)，50%SRF組中的2頭牛和100%中的1頭牛，其黃體數(shù)小于2；此外，50%SRF組中20頭牛里的8頭奶牛（40%）沒有產(chǎn)生任何可移植的胚胎，而100%組中的所有奶牛都產(chǎn)生了至少一枚可移植胚胎。

在處理期間卵泡的特性沒有什么不同，在注射促卵泡素V的當(dāng)天直徑在3-5mm的卵泡數(shù)（第4天； 18.6±1.5 VS 16.4±1.6），排卵數(shù)（13.2±1.1 VS 10.4±1.4），LH處理后的平均排卵時(shí)間（30.8±1.3h VS 30.1±2.6h）在100%SRF 稀釋組和50%稀釋組組間沒有顯著差異，然而，所有直徑＞3mm（P=0.0662；圖2）和≥9mm（P=0.08994；圖3）的卵泡在處理期間都傾向有時(shí)間和處理之間的互作作用，使得在第7天和第8天，用100% SRF 稀釋的促卵泡素組比50%的組有更大的平均卵泡直徑值（圖2）和≥9mm的卵泡數(shù)（圖3）。

在試驗(yàn)3中，在第1和2階段之間，沒有差異，所以將數(shù)據(jù)結(jié)合在一起。CL的數(shù)量、總胚胎數(shù)、受精卵數(shù)和可移植胚胎數(shù)在組間沒有差異（P＞0.05；表3）。在胚胎采集時(shí)，每組各有1頭牛其黃體數(shù)≤2，對(duì)照組中有1頭和單次注射組中有2頭奶牛沒產(chǎn)生任何可移植胚胎。

在處理期間組間卵泡特性沒有什么差異，所有直徑≥3mm（圖2）的卵泡的平均直徑，直徑在3-5mm、6-8mm和≥9mm的卵泡數(shù)都受到天數(shù)的影響（P＜0.001），但是組間沒有顯著的差異，也沒有互作影響。此外，在注射促卵泡素V的當(dāng)天直徑在3-5mm的卵泡數(shù)（第4天；19.6 ± 1.5 VS 17.6  ±  1.3)，排卵數(shù)  (15.8±1.3  VS 14.5 ±1.7)  LH處理后的平均排卵時(shí)間 (31.3± 2.3 h  VS  35.1 ± 2.3 h)，在對(duì)照組和單次注射組之間沒有顯著差異。

4 討論

總的結(jié)果顯示，用20mg/ml的透明質(zhì)酸（100%的SRF溶液）稀釋促卵泡素V，并進(jìn)行單次IM注射后，對(duì)紅安格斯供體牛有更好的超排效果，在產(chǎn)生的胚胎總數(shù)和可移植胚胎數(shù)上，與傳統(tǒng)的每日2次的IM注射的效果沒有顯著差異。值得注意的是在實(shí)驗(yàn)2和3中，49頭牛用100% SRF稀釋促卵泡素V后進(jìn)行單次注射后，僅有4頭（8%）沒產(chǎn)生任何可移植胚胎，這比以前報(bào)道的相關(guān)肉牛（24%）和荷斯坦奶牛的每日兩次IM注射的數(shù)值要小。實(shí)際上，在實(shí)驗(yàn)3中，每日兩次IM注射的29頭超排牛對(duì)照組中，僅有3頭（10%）沒有產(chǎn)生可移植胚胎，顯然和單次IM注射的超排反應(yīng)組之間沒有差異。

注射后血液中的FSH濃度，由于處理吸收位點(diǎn)和代謝清除的不同而異，按照代謝率，預(yù)測(cè)FSH以相同的速率被清除，而無論處理的方法和濃度如何。垂體提取物的快速吸收將導(dǎo)致其清除的速率加快，因此，卵泡在較大濃度的FSH的生長(zhǎng)時(shí)間減少，不能維持在排卵前。以前的文獻(xiàn)結(jié)果顯示，促卵泡素V生理鹽水稀釋、并在單次IM或SC注射后（瘦肉型動(dòng)物），血液中FSH達(dá)到相似的高濃度，并比體況較好接受了單次SC注射的奶牛體內(nèi)的FSH下降更快，推測(cè)是由于體況好的奶牛吸收較慢的原因。將FSH用聚乙烯比咯烷酮稀釋，比對(duì)照的生理鹽水稀釋將導(dǎo)致其吸收更慢、時(shí)間更長(zhǎng)、血液中FSH濃度更高。我們推斷將促卵泡素V和透明質(zhì)酸混合也將減緩吸收速度，維持血液中FSH的較高水平，因此，在單次注射促卵泡素V誘發(fā)超排反應(yīng)中，FSH的吸收速率是影響因素，而不是清楚的速率。

試驗(yàn)1的結(jié)果顯示，將促卵泡素V和透明質(zhì)酸混合單次SC耳部注射，沒有產(chǎn)生較好的效果，但單次的IM注射和目前已接受的每日2次的生理鹽水稀釋的處理效果沒有顯著的差異（盡管在數(shù)值上小一點(diǎn)），然而，將促卵泡素V和透明質(zhì)酸混合的方法將值得參考，20mg/ml的透明質(zhì)酸（100% SRF）溶液是非常粘稠的，其混合促卵泡素V后是可以觀察的到的，所以不可能從小瓶中完全的抽吸出來，因此推斷單次IM注射后較低的超排反應(yīng)可能是由于FSH比原計(jì)劃的劑量小的緣故，此推論從卵泡的生殖特性上可證實(shí)，盡管在激素處理開始時(shí)，起初的卵泡（3-5mm）數(shù)量沒有差異，而達(dá)到9mm或更大直徑的在單次注射組是較少的（圖1），故比促卵泡素V和20mg/ml的透明質(zhì)酸混合的方法外，還需探索一種更易吸取的方法，這也是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)其中使用較低濃度（10mg/ml透明質(zhì)酸；50% SRF）的透明質(zhì)酸的原因，50% SRF溶液不是十分粘稠故更容易從小瓶中吸取。

在實(shí)驗(yàn)2和3中，在注射器內(nèi)混合生理鹽水中的促卵泡素V和SRF溶液，對(duì)超排反應(yīng)更加有效。然而，50%的SRF溶液比100%的超排效果不佳，在實(shí)驗(yàn)2中，卵泡的直徑特性顯示用50%的SRF溶解促卵泡素V可誘發(fā)超排反應(yīng)，但卵泡的生長(zhǎng)似乎在延遲2天后（第6天；圖2），比100% SRF組（圖3）出現(xiàn)了較少的能達(dá)到排卵大小的卵泡，推測(cè)是由于在后半部分處理時(shí)，FSH不足的原因，正如以前在荷斯坦奶牛上用生理鹽水稀釋的促卵泡素V皮下處理的效果一樣。

在實(shí)驗(yàn)3中，與傳統(tǒng)的每日2次共4天的IM注射程序相比較，應(yīng)用20mg/ml的透明質(zhì)酸（100% SRF）稀釋促卵泡激素V后單次IM注射的效果也非常有效。在各測(cè)試的項(xiàng)目上，兩組間沒有顯著的差異，與以前文獻(xiàn)中報(bào)道的每日2次處理程序后的可移植胚胎數(shù)相比，其數(shù)量很高。值得注意的是在處理初期，對(duì)FSH易反應(yīng)的卵泡（直徑為3-5mm）數(shù)量在兩組間沒有差異，事實(shí)上，對(duì)照組的數(shù)量還占優(yōu)。另外，兩組間的排卵數(shù)和LH處理后到排卵的時(shí)間間隔上都沒有差異，兩組間無差異的卵泡生長(zhǎng)特性顯示了單次IM注射促卵泡素V可為卵泡的生長(zhǎng)至排卵階段提供充足的FSH。

實(shí)驗(yàn)3是一個(gè)用透明質(zhì)酸稀釋促卵泡激素V后單次注射誘發(fā)奶牛超排反應(yīng)的相當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏y(cè)試，相比于傳統(tǒng)的每日2次的IM注射模式，此測(cè)試不僅證實(shí)卵泡生長(zhǎng)特性，而且在測(cè)試的各變量間，包括排卵率、胚胎產(chǎn)量和更主要的可移植胚胎數(shù)都沒有差異，盡管單次IM注射處理中的最佳促卵泡素V的劑量沒有被測(cè)試，但這與每日2次注射的劑量相似，也和以前報(bào)道的單次促卵泡素SC注射的劑量相近。

5. 結(jié)論

    總的概括，相比于傳統(tǒng)的每日2次的IM注射處理程序，用20mg/ml的透明質(zhì)酸稀釋的促卵泡素V單次注射后的紅安格斯供體奶牛的超排反應(yīng)也是較好的，對(duì)于混合促卵泡素和透明質(zhì)酸的方法將是可行的，但對(duì)于安格斯牛所使用的這一劑量是否最優(yōu)還不太清楚，促卵泡素V的單次肌肉內(nèi)注射將減少超排處理中的勞動(dòng)強(qiáng)度和處理程序，特別是對(duì)于難以進(jìn)行超排處理操作的動(dòng)物而言，此方法將更加適用。